骑士夜话——微抗体(NANOBIDY)

微抗体通常指的是人工重组表达的羊驼单重链抗体的序抗原活性识别(序列变异)区域的蛋白质片段VHH。

所有抗体(免疫球蛋白)都是由淋巴细胞(血浆B细胞)分泌出的活性糖蛋白。常见免疫球蛋白(像我们人体的)有两条蛋白链,50-70kDa的重链,25kDa的轻链。根据重链的特性,免疫球蛋白又分为IgG,IgA,IgM,IgD,和IgE。其中IgG 和IgM 有高的抗原识别能力,IgM早期分泌,然后逐渐降消失。IgG则被细胞记忆,一直保持较高的分泌,用于清除后期体内的同源抗原。用木瓜蛋白酶处理IgG可讲免疫球蛋白酶切成有抗原识别能力的Fab片段和能被蛋白A、G识别的Fc片段。

单丛重链和轻链的结构上分,重链又可从氮端分为氨基酸序列变化的抗原识别的区(aa1-120, VH)和序列不变的CH1(aa121-227),CH2(aa228-341) 和CH3 (aa342-444)。轻链则只有识别抗原的轻链变异区VL(aa1-109)和轻链不变区CL(aa110-214)。VH和VL形成二聚体才有抗原识别活性。

非常有趣的是,在骆驼科动物和软骨鱼类(像鲨鱼)中,除了普通的轻-重链抗体外,还存在一种只有重链的抗体。骆驼类动物中的这种抗体能占总抗体的50-80%。这种单一重链抗体蛋白含有一个序列可变(抗原识别)区VHH和两个序列不变区CH2 和CH3,大约90kDa,而软骨鱼中的单一重链抗体则含有一个序列可变区VNAR和5个序列不变区CNAR1-5,大约150kDa。

骆驼类抗体的VHH大约有12kDa。单体,体积小,结构稳定,活性高。目前大部分微抗体VHH都是用羊驼(lama,原居住地南美洲,也叫驼羊)制备。其大体程序是,将选定的抗原免疫注射到羊驼体内,连续加强注射一定剂量让其产生抗体,然后抽取羊驼血液用密度梯度离心提取血浆B细胞,提取B细胞的全RNA作为RT-PCR模板获得DNA片段,再用VHH氮端不变的序列和CH2氮端序列设计引物和酶切位点,PCR扩增VHH的DNA编码序列,酶切后连接到噬菌体的外壳蛋白PIII或PVIII的特定位置处。再用噬菌体展示(phage display)技术对相应的抗原进行多次筛选并逐步增加筛选强度,最后得到高免疫吸附活性的噬菌体后,再将所有筛选到的噬菌体中的VHH编码序列重新切下,插入到一个特制的细菌表达载体上。这种载体的特殊不同是有一个胞周质(periplasm) 转移信号肽,一般C端还加一个组蛋白标签用于提纯。常用的表达菌株是大肠杆菌 WK6菌株,它的特点是有较大的周质空间,用常规IPTG诱导表达。表达的高活性VHH在胞周质中积累。从抗原免疫注射到大肠杆菌表达测试一般都有抗体制备公司完成。用户只提供抗原,经过公司逐步步筛选,最后得到20-30个表达VHH的克隆载体。用户得到这些载体后再根据具体研究应用从中选出最佳表达克隆。然后扩大表达,提纯制备。

微抗体的微小体积,稳定结构,高特异性,容易生产的特性使其在多领域广泛应用。用作免疫抗体,小的体积容易在人体内转运,稳定的结构在体内存活期长。在抗蛇毒免疫注射,抗癌细胞等方面已成功应用。在药物治疗方面已被用于药物靶标定向。检测学和刑警分析方面,已制备出化学药物(化学小分子)的识别文库。同时微抗体也被用于蛋白质结构学,用其固定蛋白质宜变区域,特别膜蛋白,提高结晶效率和衍射质量。随着微抗体制备方法效率的不断提高完善,其应用领域和范围都将会有突飞猛进的发展。

【作者:刘焕庭 英国圣安德鲁斯大学蛋白结构科学主任】